حلال های کروماتوگرافی HPLC

حلال ها و شوینده های HPLC کروماتوگرافی برای جداسازی آنالیت ها از یک مخلوط با استفاده از:

• یک فاز ثابت، که آنالیت در آن تقسیم شده و حفظ می شود.
• یک فاز متحرک، برای جداسازی آنالیت ها از فاز ساکن و انتقال آنها از طریق بستر فاز ثابت

آنالیت ها میل ترکیبی شیمیایی متفاوتی برای هر یک از فازها خواهند داشت. آنهایی که میل ترکیبی کمتری برای فاز ساکن دارند زودتر شسته میشوند. و آنهایی که میل ترکیبی بیشتری دارند دیرتر شسته می شوند. و در نتیجه جداسازی حاصل می شود. حلال‌ها و شوینده های کروماتوگرافی HPLC مورد استفاده برای فاز متحرک و نسبتی که در آن استفاده می‌شوند، می‌توانند برای تغییر میل ترکیبی نسبی آنالیت و در نتیجه زمان ماند و انتخاب‌پذیری (قدرت جداسازی شیمیایی) جداسازی تنظیم شوند.

در این مقاله ما به آماده سازی حلال فاز متحرک، انتخاب حلال، تأثیر قطبیت حلال بر جداسازی HPLC و خلوص حلال برای حالت های مختلف نگهداری خواهیم پرداخت.

حلال و شستشو با شوینده های کروماتوگرافی HPLC

برای پیش‌بینی یا پیش‌بینی ترتیب شستشوی آنالیت‌هایمان، باید نوع ستون کروماتوگرافی مورد استفاده و قطبیت حلال‌های فاز متحرک را نسبت به نوع آنالیت بدانیم.

معمولاً برای دستیابی به جداسازی مورد نیاز، استفاده از مخلوطی از حلال های فاز متحرک ضروری است و اولین قانون این است که این حلال ها باید امتزاج پذیر باشند. نمودارهای امتزاج پذیری حلال را می توان برای تعیین اینکه آیا دو حلال قابل امتزاج هستند یا نه استفاده کرد. 

نمودار امتزاج پذیری حلال های کروماتوگرافی HPLC

فاکتورهای زیادی وجود دارند که قدرت جداسازی سیستم کروماتوگرافی را کنترل می کنند و شامل ماهیت حلال های فاز متحرک، pH فاز متحرک و ماهیت و قدرت یونی هر بافر مورد استفاده می شود.

کروماتوگرافی فاز معکوس

 برای مثال، در HPLC فاز معکوس، کاربران معمولاً استونیتریل یا متانول (یا مخلوطی از هر دو) را با آب به عنوان دیگر ترکیب اصلی فاز متحرک انتخاب می‌کنند. متانول و استونیتریل از نظر ممان دوقطبی، اسیدیته و بازی دارای خواص اساسی متفاوتی هستند و بنابراین جداسازی هایی ایجاد می کنند که قدرت جداسازی آنها متفاوت است. با مخلوط کردن نسبت‌های مختلف این حلال‌ها یا با استفاده از پروفیل‌های گرادیان مختلف، انتخاب‌پذیری یک جداسازی ممکن است برای ایجاد بهترین وضوح بین آنالیت‌ها تنظیم شود.

 در HPLC فاز معکوس مقدار حلال آلی نسبت به جزء آبی معمولاً کم است یا کم شروع می شود و سپس در طول جداسازی گرادیان افزایش می یابد. اما در کروماتوگرافی برهمکنش هیدروفیلی (HILIC) عکس این امر صادق است. 

کروماتوگرافی فاز معمولی

در کروماتوگرافی فاز معمولی از دو حلال آلی استفاده می شود. که یکی از آنها میل ترکیبی شیمیایی بیشتری برای فاز ساکن نسبت به دیگری دارد و به همین دلیل برای جابجایی آنالیت ها استفاده می شود. و مانند اصلاح کننده آلی در کروماتوگرافی فاز معکوس عمل می کند.

انتخاب صحیح حلال های کروماتوگرافی HPLC و به دست آوردن نسبت صحیح حلال ها یک مهارت کلیدی در توسعه روش HPLC است. که یکی از آنها میل ترکیب شیمیایی بالاتری نسبت به دیگری برای فاز ساکن دارد و بنابراین برای جابجایی آنالیت ها استفاده می شود و مانند اصلاح کننده آلی در کروماتوگرافی فاز معکوس عمل می کند.

فاکتور مهم بعدی که باید در نظر گرفت این است که چگونه حلال در سیستم پمپ می شود و احتمالاً مخلوط می شود. پمپ های دوتایی و چهارتایی هر دو مزایا و معایبی دارند، اما لازم است حلال های مختلف فاز متحرک را به شکلی تکرار شونده با دقت مخلوط کنند.

 اختلاط آنلاین حلال ها در یک نسبت ثابت در طول کل تجزیه و تحلیل به عنوان حالت جداسازی ایزوکراتیک شناخته می شود. جایی که یک حلال به نسبت دیگری در یک بازه زمانی مشخص افزایش می یابد. این به عنوان گرادیان HPLC شناخته می شود و دوباره به پمپ هایی نیاز داریم که قادر به اختلاط یا تناسب دقیق در پرواز باشند.

پمپ های باینری

پمپ های باینری از 2 سر پمپ مجزا (در واقع دو پمپ مجزا و مستقل) و یک محفظه اختلاط استفاده می کنند تا جریان حجم ساکن سریع، کارآمد و کم را در سیستم شما ارائه دهند. اما تنها می توانند 2 حلال را در یک زمان تحویل دهند و همچنین گران تر هستند.

پمپ های کواترنر

پمپ های کواترنر تطبیق پذیرتر هستند زیرا می توانند تا 4 حلال را در نسبت های مختلف در طول گرادیان کار کنند، اما برای دستیابی به این هدف فقط از یک پمپ و شیرهای متناسب استفاده می کنند. نتیجه می تواند نسبت مخلوط کمی دقیق تر از سیستم باینری باشد.

یکی دیگر از مسائلی که در کروماتوگرافی باید در نظر گرفته شود، پتانسیل گازهای محلول در فاز متحرک است. که ممکن است در پمپ، ستون یا آشکارساز جمع شوند و منجر به نوسان خطوط پایه و فشار ناپایدار شوند.

برای حذف این موارد میتوان کارهای مختلفی انجام داد از جمله:

• فراصوت (بسیار موثر اما ناخوشایند)
• فیلتراسیون در خلاء (نسبتا موثر است، ذرات فیزیکی را حذف می کند اما می تواند باعث آلودگی شود)
• گاز زدای آنلاین (راحت ترین و پرکاربردترین گزینه).

فیلتراسیون فاز متحرک

برای محافظت از سیستم HPLC و ستون شما در برابر ذرات معلق، سازندگان فیلتراسیون فازهای متحرک را قبل از استفاده توصیه می کنند. این کار را می توان با دستگاه های ساده فیلتراسیون خلاء از طریق کاتالوگ های تامین HPLC انجام داد.

 تمام بافرها و اصلاح کننده ها را قبل از فیلتراسیون اضافه کنید. یک خلاء برای کشیدن حلال از طریق یک فیلتر اعمال می شود. که همچنین به طور همزمان فاز متحرک را گاز زدایی می کند. فیلترها را با موچین کنترل کنید و مطمئن شوید که دستگاه تصفیه همیشه تمیز است. نایلون 66 یک ماده فیلتر خوب برای فازهای متحرک آبی است، در حالی که PTFE یک فیلتر عالی برای اکثر حلال های آلی است. غشاهای معدنی در برابر تخریب شیمیایی از طیف گسترده ای از حلال های HPLC مقاوم هستند. توجه داشته باشید که فیلترهای تفلون به دلیل خصوصیات غیرقطبی مواد نمی توانند با آب استفاده شوند.

الزامات فیلتراسیون فازهای متحرک HPLC همیشه یک موضوع بحث داغ است. بله، ذرات فیزیکی را حذف می کند، اما شما در معرض خطر آلودگی فاز متحرک خود از طریق ذرات روی فیلتر یا سطح ظروف شیشه ای مورد استفاده قرار می گیرید، همچنین به طور بالقوه pH را از طریق تبخیر مواد افزودنی تنظیم کننده PH فرار (برای مثال تری فلورو استیک فرار است و می تواند) تحت شرایط فیلتراسیون خلاء در اتمسفر از بین می رود.  

فاز موبایل

فاز موبایل را می توان به مراحل عمده زیر تقسیم کرد:

• حجم مناسب هر حلال را اندازه گیری کنید
• PH جزء آبی را با استفاده از بافر تنظیم کنید
• هر گونه افزودنی مورد نیاز دیگر را به جزء آبی فاز متحرک اضافه کنید
• حلال ها را مخلوط کنید (در صورت نیاز برای عملیات ایزوکراتیک)
• فاز موبایل را فیلتر کنید
• فاز سیار دگاز

اکثر فازهای متحرک مخلوطی از حداقل دو حلال هستند. حجم هر حلال باید به طور مستقل اندازه گیری شود و تنظیم pH و مواد افزودنی قبل از ترکیب حلال ها به جزء آبی اضافه شود. این امر از مشکلات مربوط به تغییر حجم در مخلوط کردن حلال‌های خاص جلوگیری می‌کند.

شوینده های کروماتوگرافی HPLC

خلوص حلال بسیار مهم است زیرا می تواند بر حساسیت قابل دستیابی آنالیز تأثیر بگذارد. یک حلال خالص کمتر می تواند باعث افزایش سطح نویز پایه و همچنین پیک های ارواح شود. توصیه می شود از حلال های HPLC Grade استفاده شود.

 حلال های درجه گرادیان در هنگام استفاده از تشخیص اشعه ماوراء بنفش احتمال کمتری برای تولید پیک های ارواح دارند. برای تشخیص MS، که به ویژه در برابر ناخالصی های حلال حساس است، که ثابت دی الکتریک فاز متحرک و در نتیجه واکنش آشکارساز MS را تغییر می دهد. هنگام استفاده از حالت یونیزاسیون الکترواسپری، حلال های MS Grade برای بهینه سازی و جلوگیری از اثرات مخرب مانند سرکوب یون انتخاب مناسبی هستند.

طبق تجربه ما، کیفیت معرف باید در بین اجزای جداگانه یک مخلوط، از جمله تمام بافرهای حلال و افزودنی ها، مطابقت داشته باشد. در غیر این صورت، کیفیت و حساسیت قابل حصول توسط کم خالص ترین جزء تعیین می شود.

این اصول همچنین باید به شدت در مورد شوینده های کروماتوگرافی HPLC آبی مورد استفاده در فاز متحرک HPLC اعمال شود. اغلب این اتفاق می افتد که کیفیت آبی که تولید میشود در داخل به اندازه کافی برای حفظ کیفیت مایع شوینده کنترل نمی شود. و این می تواند منجر به هدر رفتن آن شود. ردیابی زمان منبع پیک های ارواح و دسته های ناموفق تجزیه و تحلیل نمونه.

این بدان معنا نیست که دستگاه های تصفیه آب آزمایشگاهی تجاری نمی توانند آب با بالاترین کیفیت تولید کنند. آنها می توانند. اما برای انجام این کار به طور قابل اعتماد نه تنها نیاز به سرمایه گذاری در خود تجهیزات تصفیه، بلکه یک سیستم مداوم تعمیر و نگهداری منظم و کنترل کیفیت دقیق خروجی است.

UV حلال های HPLC

هنگام انتخاب حلال‌ها باید میزان جذب UV حلال‌ها را نیز در نظر بگیرید. زیرا بسته به ماهیت و غلظت ناخالصی‌ های حلال، جذب UV در حلال ها متفاوت است.

چند نمونه از قطع جذب UV برای طیف وسیعی از حلال های HPLC به صورت زیر است:

• ایزواکتان : 197 نانومتر
• سیکلوهگزان : 200 نانومتر
• تتراکلرومتان : 265 نانومتر
• 2 پروپانول : 205 نانومتر
• اتانول : 210 نانومتر
• استونیتریل : 190 نانومتر
• متانول : 205 نانومتر
• DMSO دی‌ متیل سولفوکسید : 268 نانومتر

با کار بالاتر از برش حلال و تنظیم درست خواص جذب آشکارساز، می توان از مسائلی مانند افزایش خطوط پایه در طول تجزیه و تحلیل و/یا کاهش حساسیت آشکارساز جلوگیری کرد.

علاوه بر این، هنگامی که از حلال های درجه پایین استفاده می شود، افزایش جذب از ناخالصی های موجود در حلال ها یا ظروف حلال منجر به کاهش عملکرد تحلیلی می شود. که ممکن است به عنوان تکرار پذیری روش به خطر افتاده و کاهش حساسیت ظاهر شود.

فروش مواد شیمیایی و شیشه آلات آزمایشگاهی

مواد شیمیایی مورد نیاز خود را میتوانید از سایت مسترآزما mrazma.com سفارش دهید. فروشگاه مسترآزما عرضه کننده محصولات کمپانی های معتبر مرک merck , سیگما Sigma-Aldrich میباشد.
برای اطلاعات بیشتر از محصول روی آن کلیک کنید.

انتقادات و پیشنهادات کاربران گرامی
برای مطالعه سایر مقالات علمی و پزشکی به بخش مقالات وبسایت مستر آزما مراجعه نمایید.
در صورت نیاز به مطالعه مقاله ای خاص به کارشناسان ما اطلاع دهید تا مقاله را برای شما روی سایت قرار دهند.
نظرات خود را با ما به اشتراک بگذارید.